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植物RNA提取試劑盒（DNase I）說明書

RNApure Plant Kit（DNase I）

植物RNA提取試劑盒（DNase I）說明書

Cat. No.   K0559

保存：DNase I、10×Reaction Buffer：-20  ℃

其它組分：室  溫

組分說明

                                              Cat No.               K0559

                                              Kit Size                 50

                                              DNase I                1000 U

                                        10×Reaction Buffer           1000  μl

                                             Buffer RL               35 ml

                                            Buffer RLC               35 ml

                                            Buffer RW1               40 ml

                                    Buffer RW2（concentrate）          11 ml

                                        RNase-Free Water             10 ml

                                      Shredder Spin Column             50

                                         Spin Columns RM               50

                                    Collection Tube（1.5 ml）            50

                                     Collection Tube（2 ml）            100

產(chǎn)品簡介

    本試劑盒用于從各種植物中提取純化高品質(zhì)總 RNA，也適用于真菌菌絲RNA的提取。*的 Shredder 分離柱，用于勻質(zhì)化和過濾高粘度的植物或真菌裂解物，同時采用硅基質(zhì)膜吸附 RNA 進行純化，使多聚糖等各種污染物通過洗滌被有效去除，經(jīng)洗脫的RNA可直接用于各種下游實驗。由本試劑盒提取RNA分子量大于200堿基，純度高，幾乎無DNA殘留。

如果是對微量 DNA 非常敏感的 RNA 實驗，殘留的 DNA 可利用無 RNase 的 DNase 在柱上進行消化去除。提取的 RNA可用于 Northern Blot、Dot Blot 、RT-PCR 和體外翻譯等實驗。

注意事項

1.  預(yù)防RNase污染，應(yīng)注意以下幾方面：

    1）使用無RNase的塑料制品和槍頭，避免交叉污染。

    2）玻璃器皿應(yīng)在使用前于180℃高溫下干烤4小時，塑料器皿可在0.5 M NaOH中浸泡10分鐘，用水*沖洗后高壓滅菌。

    3）配制溶液應(yīng)使用無RNase的水。

    4）操作人員戴一次性*罩和手套，實驗過程中要勤換手套。

2.  提取的樣品避免反復(fù)凍融，否則影響 RNA 提取的量和質(zhì)量。

3.  Buffer RL 在使用前請加入β-巰基乙醇，1 ml Buffer RL 加 10 μl β-巰基乙醇。加入β-巰基乙醇的 Buffer RL 室溫可保存 1 個月。Buffer RLC 使用時不需加β-巰基乙醇。

4.  第-次使用前應(yīng)按照試劑瓶標簽的說明先在 Buffer RW2 中加入無水乙醇。

5.  Buffer RL 和 Buffer RLC 如果產(chǎn)生沉淀，請加熱使其溶解后室溫放置。

6.  所有離心步驟均在室溫下進行，且所有操作步驟動作要迅速。

自備試劑：β-巰基乙醇、無水乙醇（新開封或提取RNA）  

操作步驟

 1.   50-100 mg植物組織在液氮中迅速研磨成粉末，加入600 μl Buffer RL（使用前檢查是否加入β-巰基乙醇）或Buffer RLC。渦旋振蕩使其充分裂解。

 注意：1）Buffer RL主要成分為異硫氰酸胍，適用于大多數(shù)植物組織的裂解。但有些植物組織（如玉米的胚乳），由于次級代謝產(chǎn)物較特殊，異硫氰酸胍使樣品產(chǎn)生沉淀，導(dǎo)致RNA提取效果不佳，此時可加入Buffer RLC替代Buffer RL。

 2）56℃孵育1-3分鐘有助于組織的裂解，但是淀粉含量高的植物不要進行高溫孵育。

 2.   將步驟1所得全部液體轉(zhuǎn)移至已裝入RNase-Free 2 ml收集管（RNase-Free 2 ml Collection Tube）的Shredder Spin Column中，12,000 rpm（~13,400×g）離心2分鐘，將收集管中的上清液轉(zhuǎn)移到一個新的離心管（自備）中。

注意：1）在吸取液體時可以將槍頭剪掉，便于取樣。

2）Shredder Spin Column可以除去大部分的碎片，但仍會有小部分流出，離心后會在收集管內(nèi)形成沉淀，在進行下一步時注意避免吸到沉淀。

 3.   在步驟2所得干凈的裂解液中加入0.5倍體積的無水乙醇，迅速混勻。

注意：加入乙醇后可能會產(chǎn)生沉淀，但不影響后續(xù)試驗。

 4.   將上步得到的溶液轉(zhuǎn)移到吸附柱（Spin Columns RM）中（吸附柱已裝入收集管中）,若一次不能將全部溶液加入吸附柱中，請分兩次轉(zhuǎn)入; 10,000 rpm（~8,000 x g）離心15秒，棄掉廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

 5.   向吸附柱中加入350  μl Buffer RW1，10,000 rpm離心1分鐘，棄廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

 6.   配制DNase I  混合液：取52 μl RNase-Free Water，向其中加入8  μl 10×Reaction Buffer 和20  μl DNase I（1U/μl），混勻，  配制成終體積為80 μl的反應(yīng)液。

 7.   向吸附柱中直接加入80 µl DNase I  混合液，20-30℃孵育15分鐘。

 8.   向吸附柱中加入350  μl Buffer RW1, 10,000 rpm離心1分鐘，棄廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

 9.   向吸附柱中加入500  μl Buffer RW2（使用前檢查是否加入無水乙醇）, 10,000 rpm離心15秒,棄廢液。

 10. 重復(fù)步驟9。

 11. 將吸附柱放回收集管中，12,000 rpm離心1分鐘，將吸附柱置于室溫數(shù)分鐘，以*晾干。

     注意：這一步的目的是將吸附柱中殘余乙醇去除，乙醇殘留會影響后續(xù)的酶促反應(yīng)(酶切、PCR等)。

 12. 將吸附柱裝入新的RNase-Free 1.5 ml  收集管中，向吸附膜的中間加入30-50 μl RNase-Free Water，室溫放置1分鐘，10,000 rpm離心1分鐘，得到的RNA溶液保存在-70℃，防止降解。

 注意：1）  RNase-Free Water 體積不應(yīng)小于 30 μl，體積過小影響回收率。

2）  如果要提高RNA的產(chǎn)量，可用30-50 μl新的RNase-Free Water重復(fù)步驟12。

3）  如果要提高RNA濃度，可將得到的溶液重新加入到吸附柱中，重復(fù)步驟12。

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